IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) යනු β-galactosidase උපස්ථරයේ ප්රතිසමයක් වන අතර එය ඉතා ප්රේරණය කළ හැකිය. IPTG ප්රේරණය යටතේ, ප්රේරකයට මර්දන ප්රෝටීනය සමඟ සංකීර්ණයක් සෑදිය හැකිය, එවිට මර්දන ප්රෝටීනයේ අනුකූලතාව වෙනස් වන අතර එමඟින් එය ඉලක්ක ජානය සමඟ ඒකාබද්ධ කළ නොහැකි අතර ඉලක්ක ජානය කාර්යක්ෂමව ප්රකාශ වේ. එසේ නම් අත්හදා බැලීම අතරතුර IPTG සාන්ද්රණය තීරණය කළ යුත්තේ කෙසේද? විශාල වන තරමට වඩා හොඳද?
පළමුව, IPTG ප්රේරණයේ මූලධර්මය තේරුම් ගනිමු: E. coli හි ලැක්ටෝස් ඔපෙරෝන් (මූලද්රව්යය) හි ව්යුහාත්මක ජාන තුනක් අඩංගු වේ, Z,Y සහ A, ඒවා පිළිවෙලින් β-galactosidase, permease සහ acetyltransferase සංකේතනය කරයි. lacZ ලැක්ටෝස් ග්ලූකෝස් සහ ගැලැක්ටෝස් බවට හෝ ඇලෝ-ලැක්ටෝස් බවට ජල විච්ඡේදනය කරයි; lacY පරිසරයේ ඇති ලැක්ටෝස් සෛල පටලය හරහා ගමන් කර සෛලයට ඇතුළු වීමට ඉඩ සලසයි; lacA ඇසිටිල් කාණ්ඩය ඇසිටිල්-CoA සිට β-galactoside වෙත මාරු කරයි, එයට විෂ සහිත බලපෑම ඉවත් කිරීම ඇතුළත් වේ. ඊට අමතරව, මෙහෙයුම් අනුපිළිවෙල O, ආරම්භක අනුපිළිවෙල P සහ නියාමන ජාන I ඇත. I ජාන කේතය යනු ක්රියාකරු අනුපිළිවෙලෙහි O ස්ථානයට බන්ධනය විය හැකි මර්දන ප්රෝටීනයකි, එවිට ඔපෙරෝන් (මෙටා) මර්දනය කර අක්රිය කරනු ලැබේ. ආරම්භක අනුක්රමය P හි ඉහළට කැටබොලික් ජාන සක්රියකාරක ප්රෝටීන්-CAP බන්ධන අඩවිය සඳහා බන්ධන අඩවියක් ද ඇත. P අනුක්රමය, O අනුක්රමය සහ CAP බන්ධන අඩවිය එක්ව ලැක් ඔපෙරෝනයේ නියාමන කලාපය සාදයි. ජාන නිෂ්පාදනවල සම්බන්ධීකරණ ප්රකාශනය සාක්ෂාත් කර ගැනීම සඳහා එන්සයිම තුනේ කේතීකරණ ජාන එකම නියාමන කලාපය මගින් නියාමනය කරනු ලැබේ.
ලැක්ටෝස් නොමැති විට, ලැක් ඔපෙරෝන් (මෙටා) මර්දන තත්වයක පවතී. මෙම අවස්ථාවේදී, PI ප්රවර්ධක අනුපිළිවෙලෙහි පාලනය යටතේ I අනුපිළිවෙල මගින් ප්රකාශිත ලැක් මර්දනකය O අනුපිළිවෙලට බන්ධනය වන අතර, එය RNA පොලිමරේස් P අනුපිළිවෙලට බන්ධනය වීම වළක්වන අතර පිටපත් කිරීමේ ආරම්භය වළක්වයි; ලැක්ටෝස් ඇති විට, ලැක් ඔපෙරෝන් (මෙටා) ප්රේරණය කළ හැකිය. මෙම ඔපෙරෝන් (මෙටා) පද්ධතිය තුළ, සැබෑ ප්රේරකය ලැක්ටෝස්ම නොවේ. ලැක්ටෝස් සෛලයට ඇතුළු වන අතර β-ගැලැක්ටෝසිඩේස් මගින් උත්ප්රේරණය කර ඇලෝලැක්ටෝස් බවට පරිවර්තනය වේ. දෙවැන්න, ප්රේරක අණුවක් ලෙස, මර්දන ප්රෝටීනයට බන්ධනය වන අතර ප්රෝටීන් අනුකූලතාව වෙනස් කරයි, එය O අනුපිළිවෙලින් සහ පිටපත් කිරීමෙන් මර්දන ප්රෝටීනය විඝටනය වීමට හේතු වේ. අයිසොප්රොපයිල්තියොගලැක්ටෝසයිඩ් (IPTG) ඇලෝලැක්ටෝස් හා සමාන බලපෑමක් ඇති කරයි. එය ඉතා බලගතු ප්රේරකයක් වන අතර එය බැක්ටීරියා මගින් පරිවෘත්තීය නොවන අතර ඉතා ස්ථායී වේ, එබැවින් එය රසායනාගාරවල බහුලව භාවිතා වේ.
IPTG හි ප්රශස්ත සාන්ද්රණය තීරණය කරන්නේ කෙසේද? උදාහරණයක් ලෙස E. coli ගන්න.
ධනාත්මක ප්රතිසංයෝජක pGEX (CGRP/msCT) අඩංගු E. coli BL21 ජානමය වශයෙන් නිර්මාණය කරන ලද වික්රියාව 50μg·mL-1 Amp අඩංගු LB ද්රව මාධ්යයකට එන්නත් කරන ලද අතර, එක රැයකින් 37°C දී වගා කරන ලදී. ඉහත සංස්කෘතිය ප්රසාරණ සංස්කෘතිය සඳහා 1:100 අනුපාතයකින් 50μg·mL-1 Amp අඩංගු 50mL නැවුම් LB ද්රව මාධ්ය බෝතල් 10 කට එන්නත් කරන ලද අතර, OD600 අගය 0.6~0.8 වූ විට, අවසාන සාන්ද්රණයට IPTG එකතු කරන ලදී. එය 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 වේ. එකම උෂ්ණත්වයකදී සහ එකම වේලාවක ප්රේරණය කිරීමෙන් පසු, බැක්ටීරියා ද්රාවණයෙන් මිලි ලීටර් 1 ක් එයින් ලබා ගන්නා ලද අතර, බැක්ටීරියා සෛල කේන්ද්රාපසාරීකරණය මගින් එකතු කර SDS-PAGE පරීක්ෂණයට භාජනය කරන ලද අතර, විවිධ IPTG සාන්ද්රණයන් ප්රෝටීන් ප්රකාශනයට ඇති බලපෑම විශ්ලේෂණය කර, පසුව විශාලතම ප්රෝටීන් ප්රකාශනය සහිත IPTG සාන්ද්රණය තෝරා ගන්නා ලදී.
අත්හදා බැලීම්වලින් පසුව, IPTG සාන්ද්රණය හැකි තරම් විශාල නොවන බව සොයා ගනු ඇත. මෙයට හේතුව IPTG බැක්ටීරියා වලට යම් විෂ සහිත බවක් ඇති බැවිනි. සාන්ද්රණය ඉක්මවා යාම සෛලය ද විනාශ කරයි; සහ සාමාන්යයෙන් කිවහොත්, සෛලය තුළ ප්රකාශිත වඩාත් ද්රාව්ය ප්රෝටීන් වඩා හොඳ යැයි අපි බලාපොරොත්තු වෙමු, නමුත් බොහෝ අවස්ථාවන්හිදී IPTG සාන්ද්රණය ඉතා ඉහළ වූ විට, විශාල ප්රමාණයක් ඇතුළත් කිරීමක් සෑදෙනු ඇත. ශරීරය, නමුත් ද්රාව්ය ප්රෝටීන් ප්රමාණය අඩු විය. එබැවින්, වඩාත් සුදුසු IPTG සාන්ද්රණය බොහෝ විට විශාල නොවන තරමට වඩා හොඳය, නමුත් සාන්ද්රණය අඩු වේ.
ජානමය වශයෙන් නිර්මාණය කරන ලද වික්රියා ප්රේරණය කිරීමේ සහ වගා කිරීමේ අරමුණ වන්නේ ඉලක්කගත ප්රෝටීනයේ අස්වැන්න වැඩි කිරීම සහ පිරිවැය අඩු කිරීමයි. ඉලක්කගත ජානයේ ප්රකාශනය වික්රියාවේම සාධක සහ ප්රකාශන ප්ලාස්මිඩය මගින් පමණක් නොව, ප්රේරකයේ සාන්ද්රණය, ප්රේරණ උෂ්ණත්වය සහ ප්රේරණ කාලය වැනි අනෙකුත් බාහිර තත්වයන් මගින් ද බලපායි. එබැවින්, සාමාන්යයෙන්, නොදන්නා ප්රෝටීනයක් ප්රකාශ කර පිරිසිදු කිරීමට පෙර, සුදුසු තත්වයන් තෝරා ගැනීමට සහ හොඳම පර්යේෂණාත්මක ප්රතිඵල ලබා ගැනීම සඳහා ප්රේරණ කාලය, උෂ්ණත්වය සහ IPTG සාන්ද්රණය අධ්යයනය කිරීම වඩාත් සුදුසුය.
පළ කිරීමේ කාලය: දෙසැම්බර්-31-2021